定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術，即實時定量PCR。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。青海大學附屬醫(yī)院中心實驗室瑞士羅氏公司的實時熒光定量PCR儀（LightCycler 480Ⅱ）已開放預約，LightCycler 480Ⅱ儀器配有一個溫控模塊單元，可容納 96 孔，五個激發(fā)濾光片和六個發(fā)射濾光片隨意組合能使熒光基團得到最佳激發(fā)，并且熒光基團發(fā)射的信號能得到精確地測量。

二、應用范圍：

熒光定量PCR主要應用在定量和基因分型，定量又包括絕對定量和相對定量。

1.絕對定量分析中目的基因的濃度表達為絕對濃度，例如拷貝數(shù)，微克或微摩爾，通過與已知濃度的標準品對比，而拿到未知樣品的濃度，常用領域包括細菌、病毒的研究。

2.相對定量通常用于基因表達的研究，絕對的濃度并不重要，通常以目的基因與參比基因的相對濃度比值來表達結果，也可以引入校準樣品，來對結果進行歸一化的處理，結果也可以選擇性的進行PCR效率校正，使其更加精確。相對定量中還經(jīng)常引入校準品的概念，也就是使用校準品對最終結果進行歸一化的處理，未知樣本的相對濃度除以較正樣本的相對濃度即是歸一化的相對濃度，這對不同批次的實驗提供了一個穩(wěn)定的較正點，從而使實驗人員能夠對不同時間、不同批次的多次實驗結果進行校正。

3.基因分型包括終點法和熔解曲線法。對于已知突變位點的基因分型，使用水解探針做終點檢測，也可以使用雜交探針或簡單探針法熔解曲線的分析，對于新突變位點的篩選，比如SNP、缺失或者插入，相對于目標基因的特定區(qū)域，則使用飽和熒光染料對擴增子進行高分辨率熔解曲線分析。

終點法基因分型使用兩條序列特異性的探針，一條針對野生型、一條針對突變型，用不同的熒光基團標記。通過對擴增反應終止時的熒光信號檢測來判斷基因型。

基于熔解曲線的序列分析主要有3種，一種是通過SYBR Green I來進行產(chǎn)物特異性的鑒定，二是使用飽和染料來做高分辨率掃描，三是熒光標記雜交探針來做基因分型。

4.高分辨熔解曲線分析技術（High Resolution Melting）簡稱HRM，是近年來在國內(nèi)外興起的一種用于突變掃描和基因分型的較新的遺傳學分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的 PCR 技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在 PCR 結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、基因分型等分析。

三、實驗結果示例

1.DNA或RNA的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物轉基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2.基因表達差異分析，比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異。

3.終點法基因分型的原理是2條水解探針，分別特異性地識別、結合野生型和突變性目標DNA區(qū)域，并用不同染料標記。例如SNP檢測，甲基化檢測等。

4.HRM的主要原理是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析。它是對傳統(tǒng)熔解曲線分析的延伸，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分。

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供稿：中心實驗室 田美媛